双分子荧光互补（BiFC）
- 918博天堂间相互作用
- 高特异性
- 高迅速度
- 适用于多种生物系统
效劳特色
双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC)手艺是指通过具有相互作用亲和力的两个918博天堂质，将划分与其相连的荧光918博天堂片断拉近，组装成完整的荧光918博天堂，从而表征918博天堂质相互作用的爆发及其空间位置。
效劳先容
双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complimentary，BiFC）手艺基于918博天堂质片断互补的原理，用于研究918博天堂质间的相互作用。其原理是将荧光918博天堂（如绿色荧光918博天堂GFP、黄色荧光918博天堂YFP等）切割为两个互补但各自不发光的片断（如N端和C端片断），划分与待检测的918博天堂质A和B融合表达。当918博天堂质A与918博天堂质B在细胞内爆发相互作用时，荧光918博天堂片断靠近并重组为完整的荧光918博天堂，从而在显微镜下爆发荧光信号，直观地反应了918博天堂质间的相互作用。
效劳优势
- 活细胞内检测：能够在细胞心理状态下直接视察918博天堂质相互作用，保存了时空动态信息。
- 高特异性：只有当目的918博天堂相互作用时，荧光信号才会泛起，镌汰了假阳性效果，提高了检测的特异性。
- 检测弱或瞬时相互作用：对低亲和力、短暂相互作用敏感，能够展现一些古板要领难以检测到的相互作用。
效劳流程
客户提供
918博天堂序列信息
1、客?提供载体/模板：需要提供载体mcs测序报告/模板测序效果，如?测序报告则需另外收取测序费?，由?开瑞代为测序。
2、客?提供菌液：菌液量应≥0.5mL，安排?年以上的?油菌需活化后送样。
3、客?提供质粒：质粒量≥5μg。
4、菌液和液态质粒均需冰袋运输。
最终交付
- 剩余质粒；
- 阴、阳比照各拍1个视野，2个单分子比照和1个实验组各拍5个视野，每个视野含YFP、Bright field、Merge 3张图；
- 结题报告以及所有原始数据。
效劳说明
1、默认在烟草中举行验证，分组如图所示；
2、判断实验乐成的标准：阳性比照有荧光，且阴性比照无荧光；
3、在阴阳比照正常的条件下，若实验组检测到荧光，说明两个918博天堂能够互作，反之说明不互作。
常见问题与剖析 (Q&A)
A：为了确保荧光信号的真实性，需要扫除假阳性的可能性。假阳性可能是由于荧光918博天堂片断的非特异性相互作用或其他非目的918博天堂质之间的相互作用引起的。因此，在实验中应设置比照组，如单独表达荧光918博天堂片断或目的918博天堂的比照组，以扫除非特异性相互作用的滋扰。别的，还可以团结其他实验要领，如免疫共沉淀（Co-IP）、共定位、酵母杂交等，来进一步验证918博天堂质相互作用。
A：荧光信号较弱可能是由于荧光918博天堂片断与目的918博天堂的融合效率不高，或者融合918博天堂在细胞内的表达量较低。为了优化荧光信号，可以实验增强启动子，以提高融合918博天堂的表达水平。别的，还可以优化转染条件，确保细胞具有较高的转染效率。在制片历程中，应尽可能整理清洁叶片外貌的杂质，扫除气泡，以镌汰配景滋扰。
A：可能的缘故原由有多种。首先，可能是所研究的918博天堂质之间确实不保存相互作用，因此无法形成完整的荧光918博天堂。其次，可能是荧光918博天堂片断与目的918博天堂的融合构建保存问题，导致融合918博天堂不可准确表达或折叠。别的，实验条件、细胞状态或转染效率等因素也可能影响荧光信号的检测。针对这种情形，建议重复实验，优化实验条件，并检查融合918博天堂的表达情形。
A：BiFC手艺对实验条件确实有一些特殊要求。首先，温度是影响BiFC实验效果的主要因素。由于该系统对温度敏感，较高的温度可能导致荧光918博天堂片断不易互补形成完整的荧光918博天堂，因此需要在适当的温度下举行实验。其次，细胞的生长状态和转染效率也会影响实验效果，因此需要控制好细胞的作育条件和转染条件。别的，为了阻止配景荧光的滋扰，实验历程中需要注重操作细节，如坚持实验情形的清洁、阻止光线的直接照射等。
相关手艺效劳
| ? 酵母单杂交 | ? 酵母双杂交 | ? EMSA | ? CO-IP |
| ? CUT&Tag | ? RNA pull-down | ? RIP-qPCR | ? DNA pull-down |
| ? ChIP-qPCR | ? 双荧光素酶报告系统 | ||
相关资源
1、BIFC手艺应用
● 918博天堂质互作网络研究：展现重大信号通路中918博天堂质间的直接相互作用。
● 细胞内定位与动态研究：视察918博天堂质相互作用在细胞内的空间漫衍及其随时间的转变。
● 药物筛选与验证：检测候选药物对特定918博天堂质相互作用的影响，评估其生物活性。
● 植物科学：研究植物生长发育、逆境响应、信号转达等历程中的要害918博天堂质互作。
● 神经科学：展现神经元间或神经元内部918博天堂质的相互作用，如突触形成、神经递质释放、离子通道调控等。
● 癌症研究：研究致癌基因与抑癌基因、癌918博天堂与微情形因素的相互作用，展现癌症爆发生长的分子机制，为诊断、预后评估和个性化治疗提供依据。
2、BIFC实验流程
● 构建融合918博天堂：设计并合成针对目的918博天堂A和B的特异性引物，将其划分与荧光918博天堂N端和C端片断基因融合，构建响应的表达载体。
● 细胞转染：将含有融合918博天堂A-N端和B-C端片断的载体同时或划分转入感兴趣的细胞系，实现融合918博天堂的共表达。
● 荧光视察：转染后一段时间（通常24-48小时），使用荧鲜明微镜或共聚焦显微镜视察细胞，若视察到绿色（或对应荧光918博天堂颜色）荧光信号，说明918博天堂质A和B爆发了相互作用。
3、BIFC实验优化与注重事项
● 融合片断选择：选择对荧光918博天堂功效影响较小的片断融合位点，确保片断重组后荧光918博天堂功效恢复。
● 荧光918博天堂选择：思量荧光918博天堂的亮度、稳固性、光谱特征等因素，选择最适合实验条件的荧光918博天堂。
● 比照设置：包括阴性比照（表达单个荧光918博天堂片断的细胞）和阳性比照（已知保存相互作用的918博天堂质对）。
● 转染效率与表达水平监控：确保细胞转染效率足够高，且融合918博天堂表达水平适中，阻止过表达滋扰。
4、几种常见的918博天堂互作研究要领的比照剖析：
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要领 |
原理 | 优点 | 弱点 |
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使用酵母细胞中的转录因子举行互作918博天堂的筛选 |
适用于高通量筛选互作918博天堂 | 假阳性较高，需举行验证 | |
| 使用抗体与抗原的特异性团结，沉淀互作918博天堂 | 可用于研究完整细胞内的918博天堂互作 | 不适用于结协力弱或瞬间团结的918博天堂 | |
| 使用GST融合918博天堂与谷胱甘肽的团结特征，钓取互作918博天堂 | 可用于体外验证918博天堂互作 | 可能保存非特异性团结 | |
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双分子荧光互补（BiFC） |
使用荧光918博天堂片断的互补特征，视察918博天堂互作的荧光信号 |
可实时监测918博天堂互作的动态历程 | 可能受荧光918博天堂片断选择、细胞类型等因素影响 |
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免疫荧光共定位 |
使用荧光标记的抗体检测918博天堂在细胞内的定位 | 可用于研究918博天堂在细胞内的漫衍和互作关系 | 需要举行多重染色和显微视察，操作重大 |
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918博天堂质芯片 |
将918博天堂质牢靠在芯片上，与待测918博天堂举行互作反应 | 可高通量筛选互作918博天堂 | 芯片制备重大，本钱较高 |
每种要领都有其奇异的优点和局限性，研究者应凭证实验目的、细胞类型、918博天堂特征等因素选择合适的要领。别的，通常建议接纳多种要领举行相互验证，以提高效果的可靠性和准确性。
