一样平常，菌体的形态有：平板作育菌、穿刺作育菌，甘油生涯菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺作育菌或新鲜菌液。 ??平板作育菌运送特殊不利便，我们收到的一些平板作育菌的作育皿在运送历程中经常已经破碎，面目一新，需要用户重新寄样。这样既误时间，又铺张客户的样品。一旦是客户很是主要的样品时，其效果更不可设想。而甘油生涯菌则容易污染。 ??制作穿刺菌时，可在1.5 ml的Tube管中加入琼脂作育基，把菌体用牙签穿刺于琼脂作育基（固体）中,37℃作育一个晚上后便可使用。穿刺作育菌在4℃下可生涯数个月，并且禁止易污染，便于运送。

(1) 扩增产品必需特异性扩增，条带简单。若是扩增产品中保存非特异性扩增产品，一样平常难以获得好的测序效果。 ??(2) 必需举行胶接纳纯化。 ??(3) DNA纯化在1.6~2.0之间，浓度50ng/?l以上。

若是不举行胶纯化而直接用试剂盒接纳，经；岬贾虏庑蚍浩鹚迳踔谅曳。这主要是非特异性扩增产品或者原来的PCR产品去除不清洁导致。大大都所谓的PCR"纯化试剂盒"现实上只是接纳产品而不可起到纯化的作用。关于非特异扩增产品产品一定是无法去除，并且通常它们不可够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应历程中加入反应而导致乱峰。

PCR产品首先必需用Agarose胶电泳，将目的条带切割下，然后纯化。使用凝胶接纳试剂盒接纳。产品用ddH2O消融。

关于测序用质粒DNA的一样平常要求： ??(1) DNA纯度高，1.6~2.0之间，不可有混淆模板，也不可含有RNA，染色体DNA，918博天堂质等。 ??(2) 溶于ddH2O中，溶液不可含杂质，如盐类或EDTA等螯合剂，不然将滋扰测序反应的正常举行。

我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB，加入一个已知浓度的标准样品。电泳竣事后在紫外灯下较量亮度，判断浓度和纯度。此要领可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以判别抽提的质粒DNA的差别构型。 ??质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA历程中，由于种种缘故原由的影响，使得超螺旋的共价闭合环状的质粒（SC）的一条链断裂，酿成开环状（OC）分子，若是两条链爆发断裂，就酿成线状（L）。这3种分子有差别的迁徙率，通常，超螺旋（SC）迁徙速率最快，其次是线状（L）分子，最慢为开环状（OC）分子。使用紫外分光光度计检测，或者用EB-标准浓度DNA较量法只能检测抽提到的产品中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、918博天堂质、染色体DNA等因素的滋扰，浓度检测的数值也是没有几多意义的。

对测序引物的一样平常要求： ??(1) 特异性与测序模板团结，不可有多于4个碱基以上的错配征象 ??(2) 不可含有混淆碱基 ??(3) 长度17~25碱基 ??(4) 纯度高，最好PAGE纯化 ??(5) 用ddH2O消融，不要用TE缓冲液消融。

测序引物与待测样品DNA分子只能有一个团结位点是测序乐成的要害。若是测序引物在DNA模板分子上有不但一个的团结位点，将造成测序反应历程中引物链在几个团结位点处同时扩增，反应在测序峰图上将泛起双峰或乱峰，无法读取序列。

PCR产品测序泛起套峰征象，一样平常有以下几种缘故原由： ??(1) PCR用模板不纯或PCR用引物特异性欠好，扩增出的产品除了目的片断外，尚有与目的片断长度相近的片断，纵然用凝胶电泳也无法疏散开，这样的PCR产品测序效果是套峰。 ??(2) 结构上的缘故原由，造成了PCR产品测序泛起套峰的征象。PolyA/G/C/T以及缘故原由不明的重大结构的保存，都会泛起测序效果套峰的情形。

在测序反应中，模板或引物的缘故原由都可能造成套峰的形成，归结其形成缘故原由有以下几点 ??(1) 测序引物在模板上有两个团结位点形成套峰 ??(2) 模板不纯，若是是质；蚴蔷，缘故原由是非单克隆，若是是PCR,原由于非特异性条带 ??(3) 模板序列的特殊结构，如poly结构、发卡结构等 ??(4) 引物降解，引物不纯，或引物的特异性欠好

这里分四种情形： ??(1) 简直找不到测序使用的引物序列。现在使用的测序要领是在ddNTP上做荧光标记，测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列，由于引物自己是不做荧光标记的，所测序列是从引物3' 最后后第一个碱基最先的，以是在测序效果上找不到测序引物的序列。若是是PCR产品，要想获得PCR引物的序列，可以将PCR产品举行双链测通或者将PCR产品克隆到载体上，用载体上的引物（注重此引物也不可离插入片断太近）测序 ??(2) 找不到克隆片断的扩增引物。缘故原由可能是您在构建质粒时接纳的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的滋扰在序列最先的部分不会十分准确 ??(3) 尚有一种可能是您的插入片断的插入偏向是反的，这时您无妨找一下您引物的互补序列 ??(4) 保存单引物扩增，有一条引物的特异性欠好，有多个团结位点导致只有一条引物加入扩增

众所周知，PCR扩增历程中会泛起许多错配征象，但不可能所有的错配都爆发在统一位置。PCR片断直接测序时，其效果是PCR片断众多分子的混淆物的效果。若是在某一个点上泛起了几十次错配征象，但大大都分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该照旧准确的，在测序时，错配征象也就反应不出来了。因此，PCR片断直接测序的效果反应的是PCR用模板最原始的效果。而PCR片断经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增历程中，很难包管某一个分子的任何点都不爆发错配。因此，PCR片断经克隆后的测序效果，往往保存着一些错配的序列，和PCR片断直接测序的效果相比有些碱基会有所差别。这种错配征象的几多取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要镌汰PCR扩增历程中的错配征象，在PCR反应时，请选用保真性能高的DNA聚合酶。

一段基因序列经扩增后，克隆到载体中举行测序。在两个条理上可能导致序列爆发转变。首先，在PCR扩增历程中就可能爆发过失，将片断克隆到载体中也有可能爆发突变；其次，测序的准确率问题。 ABI公司允许其仪器的测序精度在一定规模内可以抵达98.5%以上。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中爆发碱基序列过失是难以阻止的。在确认克隆无误的情形下，通过双向测序可以最大限度镌汰测序的过失。您若是想获得您的最准确的序列，举行双向测序是很有须要的。只举行简朴的单向测序，我们无法包管所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决议的。

客户需要将测序样品或引物（客户自带的）返还时，我们在发送测序报告的同时，按客户要求寄回样品或引物（客户自带的)。 ??2）关于没返回的测序样品和引物，公司认真生涯二个月（从样品收到之日算起)，凌驾二个月还需测序的样品，宴客户另行提供。

测序用引物要求很是严酷，差别于PCR用引物。PCR用引物一样平常只要能和模板团结，3' 端的几个碱基能完全配对，纵然引物长达80~100多个碱基，只要调解PCR反应条件，也能乐成举行PCR反应。 ??而测序用引物便纷歧样了，必需严酷切合以下要求。本公司的测序用引物全用引物设计软件Oligo设计。在本公司测序时，我们可免费资助设计测序用引物。 ??●长度在15~25个碱基左右，一样平常选择20个碱基（凭证GC含量作适当调解)，3' 端只管选择G或C碱基（但一直对），以增添与模板的团结能力。 ??●Tm温度应选择50℃~70℃左右。 ??●GC含量应选择在50%左右，只管避开A、T、G、C的一连结构。 ??●避开引物自体态成发夹结构或引物二聚体结构等重大结构。 ??●包管引物和模板100%匹配，特殊是3'端的几个碱基一定要100%匹配。同时必需严酷包管引物和模板之间只能有一个团结位点。

在检查报告时，装备和918博天堂手艺员都倾向于提供应客户一个简单的信号，以是在泛起杂合的位置上给出的信号往往是较量强的一个信号。以是若是您的PCR样品上是保存杂合位点的，请在测序订单上注明，我们在修改报告时会加以注重。但若是在您预期泛起杂合信号的位置上只有简单的信号，那么我们是不会人为将其修改为杂合位点的。泛起这样的情形可能是在您的样品中杂合成份太少的信号强度缺乏以被检查到，也许有其他越发迅速的检测手段可以知足您的要求。

凌驾6Kb的DNA片断用Shot Gun 举行测序准确并且节约时间， Shot Gun要领如下： ??(1) 用物理要领打碎DNA ??(2) 接纳1~1.5K的片断 ??(3) 用核酸酶切平端，毗连入载体 ??(4) 凭证一定比例举行测序，包管每一个区段有3倍以上的数据 ??(5) 编辑所有测序数据 ??(6) 若是有缺少数据的区域，还需要增补测序，拼接成完整序列

ABI3730测序仪是接纳AB公司配套的Big DYE Terminator cycle sequencing Kit，其准确性抵达800碱基只有1个以下的过失，并且该测序仪对碱基的判读有一个自身的评判值（Quality Value），凭证QV值的巨细，也可以资助我们来判断每一个碱基的准确水平

有的客户想用测序的要领检测点突变体，我以为该要领可靠性不高。主要有以下两个缘故原由。首先，我们并不清晰突变的序列与正常的序列的比例是几多。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，若是突变的模板所占的比例很少，将直接作为配景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应系统中正常的和突变的模板量较量靠近时，才华较可靠地检测到突变体的保存。其次，在统一位置，差别碱基的信号强度一样平常是纷歧样的。这样纵然突变的模板所占的较量较高时，也纷歧定能准确检测到突变的保存。 ??另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的效果举行处置惩罚时，会只管提高主峰而将配景信号只管压低，以获得尽可能好的效果。因此，当某处泛起双峰时，测序仪一样平常会以为信号弱的峰为配景信号，在处置惩罚历程中，将弱的峰进一步压低，这样倒运于突变体的检测。因此以为，用测序的要领检测突变体的保存不是一个好的要领。