荧光定量PCR（qRT-PCR）
- 快速剖析
- 高迅速度
- 实时定量
- 基因表达剖析
效劳特色
荧光定量PCR（qRT-PCR）是一种实时监测和定量目的DNA序列品貌的手艺，普遍应用于基因表达剖析、病原体检测和突变剖析等领域。
效劳先容
实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)/qRT-PCR，是指在PCR反应系统中加入荧光标记物，使用荧光信号积累实时监测整个PCR历程，最后通过扩增曲线对未知模板举行定量剖析的要领。一样平常用于mRNA转录水平的定量研究、差别样本或基因组中DNA拷贝数的测定、基因芯片效果验证、药效剖析等。
效劳优势
- 高迅速度和高特异性：通过荧光信号的实时监测，可以准确定量目的DNA序列的品貌，具有高迅速度和高特异性。
- 快速和高通量：qRT-PCR反应时间相对较短，可以在较短时间内完成大宗样品的剖析，适用于高通量实验。
- 定量规模广：qRT-PCR可以在很是低的目的DNA浓度规模和很是高的目的DNA浓度规模内举行定量，具有普遍的定量规模。
- 可靠性和准确性：通过内部标准和质量控制，可以镌汰样品间和批次间的变异性，提高效果的可靠性和准确性。
- 多功效性：qRT-PCR可以应用于基因表达剖析、病原体检测、突变剖析、miRNA研究等多个研究领域，具有普遍的应用潜力。
效劳流程
客户提供
样品及尽可能详细的配景信息（如物种信息，扩增目的基因NCBI登录号，相关文献和样品泉源等）。
样品：组织应不少于100 mg；
细胞10^6-10^7个细胞；
细胞或组织裂解液总RNA浓度须大于1 mg/mL，单个样品不少于50 μL；
cDNA不少于30 μg。
（组织需液氮速冻、细胞收获后加入Trizol生涯于-80度。样品用干冰寄送。阻止种种污染和重复冻融。）
最终交付
- 消融曲线、Ct值及完整实验报告；
- 实验报告内容包括所提取RNA浓度、荧光定量PCR原始数据及剖析效果；
- 荧光定量PCR完整的实验办法、使用仪器、软件设置参数等。
效劳说明
| 效劳名称 | 效劳内容 | 效劳周期(事情日) |
|
荧光定量PCR (Real-time qPCR) |
通俗引物合成(客户提供特异性序列) | / |
| 通俗引物设计+合成+特异性筛选 | 3-5个 | |
| LncRNA、circRNA设计+合成+特异性筛选 | 6-8个 | |
| MicroRNA引物(客户提供颈环和qPCR特异性序列) | 12-16个 | |
| MicroRNA颈环引物设计+合成+特异性筛选 | 12-16个 | |
| RNA提取及逆转录 | 2-3个 | |
| 荧光定量PCR(不限RNA种类) | 现实样品数目来定 |
相关资源
1、荧光定量PCR（qRT-PCR）的实验办法
● RNA提。捍友分刑崛NA，确保RNA的质量和纯度。常用的RNA提取要领包括酚/氯仿法、硅胶膜柱法等。
● cDNA合成：使用逆转录酶（reverse transcriptase）将RNA转录成cDNA。反转录反应中需要引物（primers）、逆转录酶和逆转录缓冲液。反转录酶汇合成响应的cDNA，该cDNA包括了RNA样品中的目的序列。
● qPCR反应设置：将反转录爆发的cDNA与引物和荧光探针（如TaqMan探针、SYBR Green探针）一同加入PCR反应混淆物中。引物是专门设计的DNA片断，用于特异性扩增目的序列。荧光探针可以团结到扩增产品上，发出荧光信号。
● PCR扩增：通过多个循环的温度转变，即PCR扩增历程，使目的序列在DNA模板中举行扩增。PCR反应的循环包括变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）阶段。
● 荧光检测：在PCR反应的延伸阶段，荧光探针会与目的序列团结，发出荧光信号。这些信号可以通过荧光检测仪器实时监测。
● 数据剖析：通过荧光信号的强度和PCR循环数，可以盘算出目的序列的初始量或相对品貌。数据剖析要领包括阈值循环数（Ct）法、标准曲线法等。
2、qRT-PCR实验效果不如预期可能的缘故原由以及响应的解决计划
| 实验效果不如预期 |
可能的缘故原由 |
解决计划 |
| 低信号强度或不可检测的信号 |
样品中的目的RNA浓度过低 |
检查RNA提取要领和效果，重新提取样品或调解稀释倍数 |
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引物或探针的设计问题 |
重新设计引物或探针，确保与目的序列的特异性 | |
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PCR反应条件不对适 |
优化PCR反应条件，调解温度和时间以提高扩增效率和信号强度 | |
| 高配景噪音或非特异信号 |
引物或探针的特异性问题 |
重新评估引物或探针的特异性，确保与目的序列的特异性 |
|
污染或污染物滋扰 |
检查实验室情形和试剂纯净性，确保实验无菌和无污染 | |
| 异常的CT值或差别表达效果 |
实验重复性问题 |
增添实验重复次数，提高实验的重复性 |
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数据处置惩罚问题 |
审查数据处置惩罚要领和参数，确保剖析的准确性 | |
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样品异质性 |
剖析样品中的异质性泉源，如细胞亚群的保存或组织中差别细胞类型的混淆 |
3、qRT-PCR在生物学和医学研究中一些详细的应用领域和示例：
● 基因表达剖析：qRT-PCR可以用于定量丈量基因的表达水平，资助研究职员相识基因在差别条件下的转变。例如，可以使用qRT-PCR剖析药物处置惩罚后特定基因的表达转变，如药物治疗后癌症相关基因的表达调控。
● 病原体检测：qRT-PCR可用于检测和定量病原体（如病毒、细菌等）的保存和数目。例如，在临床实践中，可以使用qRT-PCR检测病毒熏染，如COVID-19病毒的检测。
● 突变剖析：qRT-PCR可以用于检测和定量DNA序列上的突变或多态性。例如，在遗传疾病研究中，可以使用qRT-PCR剖析突变基因的表达转变，进一步相识突变对基因功效和疾病生长的影响。
● miRNA研究：qRT-PCR可以用于定量丈量microRNA（miRNA）的表达水平，展现miRNA在基因调控和疾病爆发中的作用。例如，可以使用qRT-PCR剖析特定miRNA在肿瘤中的表达转变，研究其与肿瘤生长的关系。
● 表观遗传学研究：qRT-PCR可用于研究DNA甲基化和组918博天堂修饰等表观遗传标记的转变。例如，可以使用qRT-PCR剖析特定组918博天堂修饰酶的表达水平，探索其在表观遗传调控中的作用。
