免疫共沉淀(Co-lmmunoprecipitation)是使用抗原与抗体之间的专一性作用为基础,从而用于研究918博天堂质与918博天堂质之间相互作用的一种要领？固逵肓呀庖褐邢煊Φ918博天堂团结后,再与ProteinA/G偶联的Sepharose或MagneticBeads孵育,通过离心或者借助磁力架获得ProteinA/G磁珠-抗体-目的918博天堂复合物,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,网络上清,上清中包括抗体、目的918博天堂和少量的杂918博天堂,再通过Western Blot或质谱(MS)判断918博天堂质。其原理图如下:

Q1：通过CoIP后WB验证发明，没有想要的目的条带？

A：多方面缘故原由造成:

1）有可能是样品被918博天堂酶降解，对应的战略是需要添加918博天堂酶抑制剂，所有操作坚持4℃以下冰上操作且阻止重复冻融。

2）有可能是抗体浓度太低导致条带较浅，则需要调解IP或WB抗体浓度，须要时设立浓度梯度，探索最佳浓度。

3）抗体亲和力太低，选用适合于IP或者WB的抗体。

4）有的IP抗体未与磁珠团结，这种情形需选用适合IP的磁珠。

5）若Tag未袒露在融合918博天堂构象的批注，则需改变Tag融合表达部位。

6）裂解液盐碱度太高，需用低盐碱度的裂解液。

7）抗体选择不当，替换抗体。

Q2：通过CoIP后WB验证发明，虽然可见目的条带，可是配景很高：

A：多方面缘故原由造成:

1）由非特异带白团结导致配景高，若要避色主特异性带白团结，则需要在无血清溶液中裂解细胞，且在免疫沉淀前用protein(A/G)磁珠预洗免疫沉淀后增添漂洗次数和盐碱度(高盐或去垢剂)。

2）实验仪器或试剂被污染，使用清洁的仪器及现实。

3）转移膜上的目特异吸附导致配景高，实验操作历程中载手套，使用镊子来取，不要接触膜转移面。

4）制备样品中可能有不完全溶释的大的918博天堂复合体，则在制备样品后举行知暂超声处置惩罚(3次，每次5秒钟 )，然后离心，取上清后举行后续试验。

5）洗涤不彻底，则需要多次洗涤，并设新增添洗涤液中的NaCl和去垢剂浓度。

6）可能有非特异性918博天堂吸附于珠子上，则须举行Preclearing以排非特异性吸付。

7）抗体自己待异性欠好可能导数者景高，则须选择合适的抗体，可以思量单抗。

8）使用了过多的细胞或组织举行裂解导致配景高，则须镌汰样本量，推荐100-500ug细胞裂解物。

9）918博天堂降解也可能泛起高配景的情形，只管使用新鲜制备的样品。

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