实验原理
RNA pull-down是研究细胞内RNA与918博天堂/RNA团结情形的手艺。先将RNA举行标记(如生物素标记),再与细胞裂解液配合孵育,从而形成RNA-RNA/918博天堂质复合物,进而检测与之团结的RNA或918博天堂质。复合物洗脱后,通过荧光定量PCR(RNA pull down-QPCR)或高通量测序(RNA pull down-seq)要领来判断目的RNA是否与某些RNA分子相互作用,通过Western blot(pull down-WB)实验和质谱(pull down-
MS)手艺检测目的RNA是否与某些918博天堂相互作用。
实验流程
试剂盒组分
常见问题
Q1: 实验全程怎样预防RNA降解?
实验使用的所有试剂耗材需经已往RNA酶处置惩罚。
Q2:RNA pull-down?定要体外转录合成RNA探针吗?
体外转录只是获得RNA的?种?式,相比化学合成纯度更高。以是pull-down实验?般是体外转录获得目的RNA。当目的RNA序列大于2000bp时体外转录就不太容易转录乐成,这时我们可以设计合成?小段目的RNA探针,通过探针与目的RNA团结,再与918博天堂团结,便可绕过这个问题。
Q3:RNA在转录出来后,其OD?般都不高,可以使用吗?怎样定量呢?
OD值不高可举行RNA纯化,即便不纯化在实验中多加?些RNA亦可。而定量问题?般会举行琼脂糖凝胶电泳检测,可以凭证marker浓度来判断RNA的浓度。也可以用仪器丈量RNA的浓度,但通过体外转录获得的RNA浓度都能抵达2μg/uL以上。并且pull-down实验不需要准确的定量,都会加入过量的探针。
Q4:关于样本处置惩罚,细胞或者组织裂解时要不要加918博天堂酶抑制剂或RNA酶抑制剂?还需要举行其他处置惩罚吗?操作历程中需要注重什么?
细胞裂解需要加?918博天堂酶和RNA酶抑制剂,最好能够举行超声处置惩罚。另外裂解918博天堂的全程只管在冰上操作。
Q5:lncRNA引物设计有什么注重事项?或者说与通俗的引物设计有什么区别?
体外转录扩增的引物只需要在正向引物5’端加?T7启动子序列即可。
Q6:质谱判断的918博天堂主要是依据打分来举行筛?这个筛选几多分算有用?
pull-down富集918博天堂质谱剖析后会剔除不可信918博天堂,交付的都是可信918博天堂,没有明确的打分。需要排序的话?般是凭证判断918博天堂特征性肽段的数目作为参考。
Q7:做lncRNApull down+质谱?般都会发明多个互作918博天堂对吗?怎样选择哪一种918博天堂继续研究下去?
差别的RNA团结918博天堂数目不等,凭证现实判断的918博天堂举行筛;筛选的原则是凭证自己研究的偏向或相关功效确定这类918博天堂。