转染效率低、滋扰效果差、重复性欠佳...siRNA研究频遇“拦路虎”怎么办？别怕，一文教你轻松KO
在现代生命科学研究的舞台上，小滋扰RNA（Small Interfering RNA, siRNA）犹如一把精准调控基因表达的“手术刀”，以其高度特异性和高效性在基因默然领域展现出了无可相比的优势 。siRNA，这一由双链RNA分子组成的短片断，通过与细胞内特定mRNA序列准确互补配对，触发RNA滋扰（RNA Interference, RNAi）机制，有用抑制对应基因的翻译，从而实现对基因功效的暂时、可逆性关闭 。这一要害性手艺不但为研究职员翻开了深入探讨基因功效、剖析重大生物学历程的大门，更为疾病的分子机制研究、药物靶点筛选以及基因疗法开发提供了强盛的工具 。
图源：https://www.cnki.net
siRNA的应用领域普遍而深远，无论是基础研究中的基因功效验证、信号通路剖析，照旧转化研究中的药物靶标验证、疾病模子构建，以致临床研究中的个性化治疗探索，siRNA都以其奇异的手艺优势施展着不可或缺的作用 。其高度定制化特征使得研究职员能够针对任何已知基因设计并合成特定siRNA，实现精准的基因敲低，极大地推动了生命科学各个领域的研究历程 。
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然而，只管siRNA手艺的潜力与价值毋庸置疑，现实应用历程中仍碰面临诸如转染效率、实验重复性、基因滋扰效果等一系列手艺挑战 。这些问题的妥善解决关于充分验展siRNA手艺的潜力，确保研究效果的准确性和可靠性至关主要 。918博天堂工程有限公司是一家专业致力于为全球制药企业、诊断试剂企业、科研试剂研发企业、高校和科研院以是及大型医院提供核酸及918博天堂相关研究手艺效劳的高新手艺企业 。自2013年建设以来，我们已经积累了凌驾10年的项目履历，并拥有专业的手艺团队 。接下来，我们将针对siRNA研究中常见的问题举行深入探讨，并提供科学、适用的解答与应对战略 。
Q：siRNA转染常见问题与建议有哪些？
A：为包管诱饵918博天堂功效的完整性，首先我们会思量用3’AT/ABA举行配景抑制，可是由于这两种试剂对酵母生长具有较大的毒性，后续可能会影响文库筛选，因此在3’AT凌驾15mM，ABA凌驾1200ng/ml时我们会思量将诱饵918博天堂举行截断，通过查阅文献和相关数据库，截去转录激活的区域，可是需要注重的是，截去的这一部分很有可能会影响到互作效果 。
Q：siRNA转染常见问题与建议有哪些？
A：
Q：我们需要提供什么信息用于 siRNA 的合成？金开瑞可以资助免费设计吗？
A：您需要准确地提供 siRNA 的 19 个核苷酸的靶序列和悬垂的合成物，或者您也可以提供响应地基因的 Gene ID 或者 Accession Number，由金开瑞公司手艺职员为您免费设计 。
Q：用 100nM 的 siRNA 转染时只获得 50%默然效率，我可以将 siRNA 的浓度增添到 200nM 甚至400nM 吗？
A：增添 siRNA 的浓度一样平常不可刷新默然效率 。高浓度的 siRNA 将可能导致去靶作用和对细胞的毒性 。siRNA 的高基因默然效率来自于合理的设计，在 100nM 甚至更低的浓度都可能有 75%的默然效率 。另外，低的转染效率会导致低的默然效率，建议您更进一步优化 siRNA 的导入条件 。
Q：默然效果不睬想，应该如那里置？
A：最常见的影响默然效果的两个缘故原由是：转染效率低和 siRNA 序列设计的效果不睬想 。若是您首次使用 siRNA 或接纳了新的细胞系，并发明默然效果不佳，我们建议您对转染效率举行检测，并选择优化转染条件 。若是您已经对实验转染条件举行优化可是问题依然保存，我们建议您换用另一种转染试剂或是接纳其他手艺，这也许能提高转染效率 。若是已经提高了转染效率可是默然效果仍然未抵达要求，可能是由于siRNA序列设计的效果不睬想 。
Q：一定需要阴性比照吗？
A：是，阴性比照是 RNA 滋扰实验中不可缺氨赡 。由于在凌驾 200nM 的浓度下，siRNA 有可能会导致非特异性的压力反应，在实验系统中必需设置阴性比照 。它能够资助我们确认基因表达水平的降低是否是序列特异性的 RNAi 的效果 。由于 siRNA 的合成要领和工艺以及转染试剂等因素可能导致普遍的基因默然征象 。若是没有阴性比照，研究职员很可能过失地将普遍的、非特异性基因默然看成由 RNAi 引起的基因特异性默然 。
Q：常用的阴性比照有哪些类型？
A：常用的阴性比照概略分为两种，一种是使用通用阴性比照序列，该序列已经被上千篇文章使用；另一类是使用和靶基因 siRNA 打乱序列的 siRNA 作为阴性比照，这样的阴性比照和通用序列相较量，一方面合成是凭证定制产品价钱合成的，另一方面，由于打乱序列是没有经由验证的序列，有可能会爆发 off target 征象 。因此，除非有很是特殊的要求，最好使用通用序列作为阴性比照 。
Q：在阴性比照系统中和实验系统中视察到同样的实验效果，这是什么缘故原由？
A：这个效果充辩白明晰设置阴性比照的须要性 。该效果批注您所视察到的表型不是序列特异性knockdown爆发的表型，您需要降低 siRNA 的事情浓度 。
Q：用于比照的 siRNA 的最佳浓度是几多？
A：阳性比照和阴性比照的 siRNA 的浓度都应该与基因特异性的 siRNA 的浓度相同 。
Q：在 siRNA 上举行标记的最佳位点在那里？
A：反义链的 5'端标记会影响 siRNA 的默然活性，以是不推荐标记这个位点 。在其他三个最后举行标记对默然活性险些没有影响 。有研究批注正义链的 5'端标记是最有用的化学合成位点 。
Q：金开瑞siRNA套餐有什么优势？
A：订购金开瑞siRNA套餐，资深手艺设计siRNA，在包管细胞转染效率（≥80%）的条件下，siRNA可抵达70%以上的默然效果 。若经qRT-PCR判断，套餐中3对siRNA均未抵达70%或以上的默然效果，金开瑞将凭证您提供的实验效果举行剖析 。如核实为siRNA设计问题，则重新设计并免费合成针对靶基因的另外3对siRNA 。特殊物种（除人，小鼠，大鼠以外）及lncRNA除外 。
Q：金开瑞的siRNA套餐包括哪些内容？
A：金开瑞的siRNA套餐内里含有针对目的基因设计的3条siRNA，赠予通俗NC，NC-FAM，阳性比照 。
1、NC-FAM：实验最先前，请先用NC-FAM举行预实验，凭证您用的转染试剂说明书转染NC-FAM，换液后可通过荧光直接视察明确最佳转染效率后再举行后续实验安排 。一样平常情形FAM在转染后48小时内就会淬灭 。
2、阳性比照用途：提供的GAPDH siRNA均为验证过有用的siRNA 。若是实验组和GAPDH组都未泛起有用下调则有可能实验转染办法保存问题，请优化实验条件后再举行响应实验 。
3、NC：用于确保实验历程中其它因素导致了目的基因的RNA水平转变 。NC组实验效果应与空缺组实验效果一致 。
Q：siRNA 导入到细胞内选哪种要领？
A：使用什么样的转染要领，很洪流平上取决于您使用的细胞系：1.贴壁的、易转染的细胞，我们推荐使用 Lipofectamin 2000 或 siRNA Mate 转染试剂 。2.悬浮的或原代的细胞，我们推荐使用电击转化要领；3.电击转化效率仍然很低的细胞，需要选择载系一切 。
Q：刚最先接触 RNA 滋扰手艺，经费有限，怎样确定研究系统？
A：在最先 RNA滋扰研究之初，需要确定以下几个方面：使用化学合成的 siRNA 照旧使用载体构建 shRNA？我们推荐使用化学合成的要领来筛选有用的目的片断，然后把筛选出来的目的片断插入到载体，举行抗性筛选，获得稳固表达的细胞株，再做恒久研究 。
Q：反义核酸和 RNAi 有何差别？
A：反义核酸和 RNAi 从作用原理到使用的规模都有很大差别 。这里只能做一个简朴的先容：从原理上说，反义核酸是一段与靶基因配对的单链 DNA 或类似 DNA 的片断与靶基因团结，效果阻止靶基因的转录或是翻译，以往的研究批注在反义核酸的研究中，序列的有用性和有用序列的非特异性往往有较量高的正相关性，这就在一定水平上限制了反义核酸的应用 。RNAi的作用机理是双链的RNA进入细胞内，导致靶基因的切割和降解 。siRNA 的序列可以选择在高度特异针对靶基因的位置，也就为RNAi作为药物研究提供了高效、低副作用的空间 。自从RNAi手艺问世以来，外洋许多专业从事反义核酸研究的公司都纷纷转向 RNAi研究 。
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参考文献：
J. Shen, W. Zhang, R. Qi, et al., Engineering functional inorganic-organic hybrid systems: advances in siRNA therapeutics [J]. Chemical Society Reviews, 2018, Vol.47 (6): 1969-1995.
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RNAi 手艺在抑制 H B V 复制和表达中的应用
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