918博天堂

双荧光素酶检测是转录调控研究中?分主要的实验?段
，主要应?于启动?和转录因?
，以及miRNA和其靶基因互作的验证。

• 在双荧光素酶检测中
  ，将萤??荧光素酶作为实验报告基因
  ，海肾荧光素酶作为比照报告基因。实验报告基因?于测试实验条件下基因的表达
  ，?比照报告基因作为内比照。
• 以荧光素为底物来检测萤??荧光素酶活性
  ，荧光素酶可以催化荧光素
  ，在荧光素氧化的历程中会发出?物荧光
  ，然后通过化学发光仪测定。

原理简介

● 转录因?与启动?

将启动子序列构建到萤火虫荧光素酶基因前
，同时过表达转录因子。当转录因子与启动子上特异团结位点团结后激活荧光素酶基因转录
，使萤火虫荧光素酶得以表达
，最终荧光强度上升；当团结位点被突变后
，转录因子无法与启动子团结
，因此荧光值无显着转变。

● miRNA与靶基因

将靶基因序列构建到萤火虫荧光素酶基因3'区域
，同时过表达microRNA。当microRNA与靶基 因上特异团结位点团结后
，将滋扰荧光素酶mRNA的翻译或导致其迅速降解
，使荧光强度降低；当团结位点被突变后
，microRNA无法与靶基因团结
，因此荧光值无显着转变。

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YY1-mediated reticulocalbin-2 upregulation promotes the hepatocellular carcinoma progression via activating MYC signaling.

期刊：Am J Cancer Res   IF：5.177

Schematic illustration of YY1 binding site on the wild type and mutant RCN2 promotor. Fluorescence activity in Huh7 cells with RCN2 wildtype and mutant promotor with YY1 pcDNA3.1.

凝胶迁徙或电泳迁徙率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay
，EMSA）是一种检测918博天堂质和DNA 序列相互团结的手艺
，可用于定性和定量剖析。现在已用于研究DNA 团结918博天堂和特定的DNA 序列的相互作用
，是转录因子研究的经典要领。

金开瑞提供EMSA 检测手艺效劳
，资助您检测DNA 团结918博天堂、RNA 团结918博天堂、特定的918博天堂质。

原理简介

目的918博天堂与生物素标记的DNA探针团结
，电泳时918博天堂-DNA复合物比无918博天堂团结的DNA探针在凝胶中泳动的速率慢
，显影泛起相对滞后条带。

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Functional Analysis of IRF1 Reveals its Role in the Activation of the Type I IFN Pathway in Golden Pompano, Trachinotus ovatus (Linnaeus 1758).

期刊：Int J Mol Sci.   IF：4.183

Binding reactions of IRF1 and ToIFNa3 prompter. Biotin-labeled EMSA probes were incubated with lysates of HEK293T cells containing ToIRF1 protein.WT,wild-type probe;MT:mutated probe.1,negative control;2,positive control;3,plus ToIFNa3-P2-WT5;4,ToIFNa3-P2-WT5 plus ToIRF1-Flag;5,plus ToIFNa3-P2-MT5;6,ToIFNa3-P2-MT5 plusToIRF1-Flag.

ChIP染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation
，ChIP）是用来研究918博天堂质与DNA是否在体内保存相互作用
，这项手艺资助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会泛起何种组918博天堂修饰。使用抗体抗原特异性团结
，将与目的918博天堂相团结的DNA片断沉淀下来
，能够真实地反应团结在DNA序列上的调控918博天堂。

原理简介

细胞牢靠

染色质断裂

染色质免疫沉淀

交联反应的逆转

DNA的纯化及判断

PCR或高通量测序

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YAP inhibits autophagy and promotes progression of colorectal cancer via upregulating Bcl-2 expression

期刊：Cell Death Dis   IF：6.304

C ChIP-qPCR was performed in SW620 cells transfected with pcDNA3.1-HA-YAP to identify the enrichment of HA-YAP onto Bcl-2 promoter region. IgG served as an antibody control.

DNA pull down是用于剖析918博天堂质与DNA互作的一种剖析手艺。一样平常来说
，该实验首先需要针看待研究目的基因的调控区域设计并制备特异性探针（以脱硫生物素标记为主流）；同时
，制备细胞核提取物；将探针和核提取物配合孵育
，DNA团结918博天堂就会和靶向序列特异性团结；然后
，通过亲和素磁珠纯化918博天堂质DNA复合物；最后针对获得的918博天堂
，使用WB验证或者质谱方法判断918博天堂质类型。

应用：寻找已知的启动子序列所团结的未知918博天堂（转录因子）

原理简介

体外合成生物素表达的DNA片断

提取细胞918博天堂

生物素标记的DNA片断和细胞提取物

孵育

洗涤
，洗脱

剖析

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效果：实验组和比照组之间保存差别条带

酵母单杂交手艺是在酵母双杂基础上生长而来的一种研究核酸-918博天堂相互作用的工具
，被普遍用于研究真核细胞内基因的表达调控
，如判别DNA团结位点发明潜在的团结918博天堂基因、剖析DNA团结结构域信息等。

原理简介

核酵母单/双杂交系统原理：酵母转录因子Gal4包括DNA团结结构域（Gal4-BD）和转录激活域（Gal4-AD）
，诱饵（prey）与Gal4-BD融合
，猎物（bait）918博天堂与Gal4-AD融合
，当诱饵和猎物爆发相互作用时
，Gal4-BD和Gal4-AD在空间上充分靠近
，可泛起完整的GAL4转录因子活性
，启动激活报告基因AUR1-C、ADE2、HIS3和MEL1的转录。

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1: Pabai-Bait+PGADT7(自激活验证)
2: Pabai-Bait+PGADT7-Prey(实验组)
+: Pabai-P53+PGADT7-53(阳性比照)
- : Pabai-P53+PGADT7(阴性比照)

918博天堂质与RNA 的相互作用是许多细胞功效的焦点
，如918博天堂质合成、mRNA 组装、病毒复制、细胞发育调控等。使用体外转录法标记生物素RNA 探针
，然后与胞浆918博天堂提取液孵育
，形成RNA-918博天堂质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠团结
，从而与孵育液中的其他因素疏散。复合物洗脱后
，通过WB 实验检测特定的RNA 团结918博天堂是否与RNA 相互作用。若待检测目的918博天堂明确
，选择WB判断；若不明确
，则可选择质谱判断。

金开瑞现提供RNA pull down 检测手艺效劳, 使用特异性二抗举行检测
，能有用阻止抗体重链对效果的信号滋扰。并且金开瑞配套自己的质谱平台
，能显著提升检测效果。

原理简介

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Circular RNA circEsyt2 regulates vascular smooth muscle cell remodeling via splicing regulation

期刊：J Clin Invest   IF：11.864

CircEsyt2 inhibits the nuclear trafficking of PCBP1 by binding directly to PCBP1. (A) Western blotting of proteins pulled down by control and circEsyt2 probes in circEsyt2-OE HEK293T cells using the PCBP1 antibody. (B) Identification of circEsyt2-binding proteins. Left: silver staining of pulled-down proteins in circEsyt2-OE HEK293T cells. Right: mass spectrometry showing the main proteins pulled down by the circEsyt2 probe.

RIP 手艺（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay
，RNA 团结918博天堂免疫沉淀）主要是运用针对目的918博天堂的抗体把响应的RNA-918博天堂复合物沉淀下来
，然后经由疏散纯化就可以对团结在复合物上的RNA 举行q-PCR验证或者测序剖析。RIP 是研究细胞内RNA 与918博天堂团结情形的手艺
，是相识转录后调控网络动态历程的有力工具
，可以资助我们发明miRNA 的调理靶点。

凭证客户需求
，金开瑞可以提供RNA/918博天堂、RNA/RNA互作验证RIP手艺效劳。

原理简介

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CircPVT1 promotes proliferation of lung squamous cell carcinoma by binding to miR-30d/e

期刊：J Exp Clin Cancer Res   IF：11.161

c RIP confirmed the relationship between circPVT1 and HuR in H520 cells. GAPDH mRNA was used as a non-HuR target control.

使用带有标签的已知918博天堂作为诱饵918博天堂（最常用的是GST标签
，即谷胱甘肽巯基转移酶
，glutathione S-transferase）
，诱饵918博天堂特异性团结谷胱甘肽亲和树脂
，当目的918博天堂溶液过柱时
，将诱饵918博天堂及其相互作用的918博天堂复合物捕获。复合物洗脱后
，通过918博天堂凝胶电泳剖析两种918博天堂间的相互作用
，或者筛选响应的目的918博天堂。

原理简介

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Aberrant oligodendroglial LDL receptor orchestrates demyelination in chronic cerebral ischemia

期刊：J Clin Invest   IF：11.864

(C) GST pull-down assay revealing the interaction between LDLR and Shc (n = 3 in each group).

免疫共沉淀手艺（co-Immunoprecipitation, co-IP）是一种研究两种918博天堂在体内是否保存相互作用的有用要领
，通过抗体和已知918博天堂团结
，从而捕获整个已知918博天堂复合物
，进而研究复合物中与已知918博天堂保存相互作用的918博天堂。

原理简介

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Aberrant oligodendroglial LDL receptor orchestrates demyelination in chronic cerebral ischemia

期刊：J Clin Invest   IF：11.864

LDLR protects against demyelination by binding Shc and activating downstream MEK/ERK signaling. (A) Immunoassay of lysates of cerebral CC tissue after immunoprecipitation with LDLR, analyzed by immunoblotting (IB) with anti-LDLR and anti-Shc (n = 3 in each group).

酵母双杂交及系统是一种判断和检测918博天堂质相互作用的研究要领
，因其具有迅速性高、功效强盛、适用规模广等特点
，现已被应用于多个研究领域。

金开瑞可提供酵母杂交文库构建、核酵母双杂交筛选、膜酵母双杂交筛选、酵母单/双杂交验证效劳。

原理简介

膜酵母双杂交系统原理：泛素ubiquitin包括N 端（Nub）
，C 端（Cub）结构域。首先
，人为的将泛素 Nub的第3位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI 突变为 NubG）。这样与 Cub 的亲协力大大降低
，阻止了 Cub 和 Nub 自我团结或靠近的可能性。在Cub结构域融合LexA-VP16 转录激活因子形成Cub-LexA-VP16。诱饵918博天堂（prey）与NubG融合
，猎物918博天堂（bait）与Cub-LexA-VP16融合。
，当当诱饵和猎物爆发相互作用时
， NubG 和 Cub 的相互靠近
，团结
，形成完整泛素ubiquitin
，从而被 UBPs 酶识别
，导致 LexA-VP16 的剪切
，进入核内
，从而激活报告基因AUR1-C、ADE2、HIS3和MEL1的转录。

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① 酵母杂交文库构建

图?泉源于 Xu et al. BMC Biotechnology (2020) 20:4

② 酵母双杂交筛选

阳性效果点钟SD/-Leu/-Trp/-HIS3/-ADE2+X-α-gal平板

图?泉源于 Xu et al. BMC Biotechnology (2020) 20:4

阳性效果PCR判断

图?泉源于 Xu et al. BMC Biotechnology (2020) 20:4

③ 酵母杂交验证（可用于文章揭晓）

1: PGBKT7-Bait+PGADT7(?激活验证)
2: PGBKT7-Bait+PGADT7-Prey(实验组)
+: PGBKT7-53+PGADT7-T(阳性比照)
- : PGBKT7-lam+PGADT7-T(阴性比照)

双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complimentary
，BiFC）手艺基于918博天堂质片断互补的原理
，用于研究918博天堂质间的相互作用。其原理是将荧光918博天堂（如绿色荧光918博天堂GFP、黄色荧光918博天堂YFP等）切割为两个互补但各自不发光的片断（如N端和C端片断）
，划分与待检测的918博天堂质A和B融合表达。当918博天堂质A与918博天堂质B在细胞内爆发相互作用时
，荧光918博天堂片断靠近并重组为完整的荧光918博天堂
，从而在显微镜下爆发荧光信号
，直观地反应了918博天堂质间的相互作用。

原理简介

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